賽默飛（Thermo Fisher）實(shí)時熒光定量PCR儀是現(xiàn)代分子生物學(xué)中常用的分析工具之一，其廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原檢測、突變檢測等研究領(lǐng)域。特別是其7500型實(shí)時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System），以其精確的溫控系統(tǒng)、靈敏的熒光信號檢測能力、以及用戶友好的操作界面，成為許多實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備。以下是關(guān)于7500型實(shí)時熒光定量PCR儀的詳細(xì)使用步驟和原理說明。

1. 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)簡介

實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）是一種高靈敏度的基因擴(kuò)增技術(shù)，通過熒光信號監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中的DNA擴(kuò)增。其基本原理是在PCR反應(yīng)中加入帶有熒光標(biāo)簽的探針或染料，通過實(shí)時檢測熒光信號的變化，推測出目標(biāo)DNA的初始數(shù)量。與傳統(tǒng)PCR不同，實(shí)時PCR能夠在PCR擴(kuò)增過程中實(shí)時監(jiān)測產(chǎn)物的數(shù)量，因此可以獲得更為精準(zhǔn)的定量數(shù)據(jù)。

2. 賽默飛7500型實(shí)時熒光定量PCR儀概述

賽默飛7500型PCR儀采用先進(jìn)的光學(xué)檢測系統(tǒng)和精密的溫控系統(tǒng)，能夠提供高度精確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。其主要特點(diǎn)包括：

• 多通道熒光檢測：7500型儀器具有多達(dá)6個熒光通道，支持不同熒光探針或染料的同時檢測，適用于多重PCR反應(yīng)。

• 高效的熱循環(huán)系統(tǒng)：儀器采用精密的熱循環(huán)技術(shù)，溫控精度和均勻性較高，能夠確保擴(kuò)增反應(yīng)的高效進(jìn)行。

• 用戶友好的操作界面：7500型PCR儀配備大尺寸觸摸屏，操作界面直觀，支持?jǐn)?shù)據(jù)實(shí)時顯示、分析與報告生成。

3. 設(shè)備安裝與準(zhǔn)備

在使用7500型實(shí)時熒光定量PCR儀之前，首先需要完成設(shè)備的安裝和調(diào)試工作。這些步驟包括：

3.1 安裝與檢查

• 位置選擇：選擇一個穩(wěn)定、無強(qiáng)電磁干擾和溫度波動的地方來放置PCR儀器。避免直射陽光和震動，確保設(shè)備的穩(wěn)定性。

• 設(shè)備連接：連接電源線、計算機(jī)（如果需要）和網(wǎng)絡(luò)（如有需要）。確保所有連接無松動。

3.2 啟動與自檢

• 打開設(shè)備電源，設(shè)備會自動進(jìn)行自檢。此過程是為了確保硬件系統(tǒng)的正常運(yùn)作，檢查如熱循環(huán)系統(tǒng)、熒光檢測系統(tǒng)等關(guān)鍵部件。

• 檢查液晶屏是否正常顯示，儀器是否能夠順利進(jìn)入操作界面。

4. PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備

4.1 樣品和試劑準(zhǔn)備

• DNA模板：提取所需的DNA模板，通常需要在PCR前進(jìn)行核酸純化，確保模板的純度和濃度適合實(shí)驗(yàn)要求。

• 引物和探針：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計特異性的引物和探針。設(shè)計時需注意引物的長度、GC含量、退火溫度等因素，以確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。

• PCR反應(yīng)混合物：PCR反應(yīng)體系一般包括模板DNA、引物、探針、熒光染料（如SYBR Green或TaqMan探針）、PCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶等。需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求調(diào)整反應(yīng)體系的組成。

4.2 配制反應(yīng)液

• 按照試劑盒說明書或?qū)嶒?yàn)設(shè)計配制PCR反應(yīng)液，保證每個反應(yīng)孔中加入合適量的反應(yīng)液和模板。

• 一般來說，反應(yīng)液的總量可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計設(shè)置，通常每個反應(yīng)孔的體積為20-50 μL。

4.3 樣品的加載

• 將配制好的反應(yīng)混合物和模板按實(shí)驗(yàn)設(shè)計分配到PCR板的各個孔中。確保每個孔的液體量一致，并且避免產(chǎn)生氣泡。

• 樣品加載完成后，使用PCR板封膜，確保密封良好。

5. 實(shí)時熒光定量PCR程序設(shè)置

5.1 創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)

• 在7500型PCR儀的觸摸屏上，選擇“新建實(shí)驗(yàn)"選項(xiàng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求設(shè)置反應(yīng)條件，如擴(kuò)增循環(huán)數(shù)、退火溫度、熒光通道等。

• 選擇合適的PCR反應(yīng)體系類型，例如SYBR Green染料體系或TaqMan探針體系。

5.2 設(shè)置PCR程序

• 熱啟動：大多數(shù)PCR反應(yīng)體系需要在初始階段進(jìn)行熱啟動，以激活DNA聚合酶，避免非特異性擴(kuò)增。

• 擴(kuò)增程序：設(shè)置適合的擴(kuò)增程序，通常包括變性、退火、延伸三個步驟。對于SYBR Green染料體系，通常需要一個較長的退火/延伸時間來確保信號的準(zhǔn)確檢測。

• 數(shù)據(jù)采集：在每個擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束時，選擇熒光信號采集時間點(diǎn)。一般來說，實(shí)時PCR儀會在延伸步驟后進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)的采集。

5.3 啟動實(shí)驗(yàn)

• 在確認(rèn)所有參數(shù)設(shè)置無誤后，點(diǎn)擊“開始"啟動PCR實(shí)驗(yàn)。儀器將根據(jù)設(shè)置的程序自動進(jìn)行反應(yīng)。

6. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與數(shù)據(jù)處理

6.1 實(shí)時數(shù)據(jù)監(jiān)測

• 在實(shí)驗(yàn)過程中，7500型PCR儀會實(shí)時顯示擴(kuò)增曲線和熒光數(shù)據(jù)。用戶可以隨時查看實(shí)驗(yàn)進(jìn)度和熒光信號變化。

• 在PCR反應(yīng)過程中，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，熒光信號逐漸增強(qiáng)。通過熒光信號的閾值設(shè)置，可以確定擴(kuò)增的起始點(diǎn)（Ct值）。

6.2 數(shù)據(jù)分析

• Ct值分析：通過分析不同樣品的Ct值，可以確定目標(biāo)基因的表達(dá)量或DNA的初始拷貝數(shù)。Ct值越小，表示樣品中目標(biāo)基因的初始濃度越高。

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線：為了定量測定目標(biāo)基因的相對或絕對表達(dá)量，可以使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過該曲線來計算樣品中目標(biāo)基因的濃度。

• 相對定量分析：在基因表達(dá)分析中，通常采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析。通過比較實(shí)驗(yàn)組和對照組的Ct值，可以得出目標(biāo)基因在不同樣本中的相對表達(dá)水平。

6.3 數(shù)據(jù)導(dǎo)出與報告生成

• 實(shí)驗(yàn)完成后，用戶可以通過設(shè)備的分析軟件導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并生成報告。報告中包含擴(kuò)增曲線、Ct值、標(biāo)準(zhǔn)曲線等相關(guān)數(shù)據(jù)。

7. 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)與故障排除

7.1 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

• 模板質(zhì)量：模板的質(zhì)量直接影響PCR的結(jié)果，應(yīng)確保模板無污染且濃度適中。

• 引物設(shè)計：引物設(shè)計不合理可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或非特異性擴(kuò)增，因此設(shè)計時要保證引物的特異性和二聚體形成的最小化。

• 反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體系需要根據(jù)試劑和樣品的具體情況進(jìn)行優(yōu)化，以提高擴(kuò)增效率和信號的靈敏度。

7.2 常見故障與解決

• 無擴(kuò)增或擴(kuò)增信號弱：可能是模板量不足、引物設(shè)計不合理、PCR條件設(shè)置不當(dāng)?shù)葐栴}導(dǎo)致。應(yīng)檢查模板質(zhì)量、引物特異性及PCR程序設(shè)置。

• 非特異性擴(kuò)增：可以通過優(yōu)化引物退火溫度或使用特異性更強(qiáng)的探針來避免非特異性擴(kuò)增。

• 熒光信號偏低：可能是染料添加量不足、熱循環(huán)條件不合適等原因?qū)е?。檢查熒光染料的濃度和PCR反應(yīng)條件。

8. 總結(jié)

賽默飛7500型實(shí)時熒光定量PCR儀以其高精度的溫控系統(tǒng)和靈敏的熒光檢測能力，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原檢測、基因變異分析等研究領(lǐng)域。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件和合理設(shè)計反應(yīng)體系，研究人員可以獲得高質(zhì)量的定量PCR數(shù)據(jù)。