實時熒光定量PCR儀
實時熒光定量PCR儀(Real-Time Quantitative PCR,qPCR)是一種用于定量分析核酸(DNA或RNA)擴增的儀器。該技術(shù)結(jié)合了聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和熒光探針技術(shù),可以在PCR反應(yīng)過程中實時監(jiān)測核酸擴增,廣泛應(yīng)用于分子生物學、醫(yī)學診斷、基因表達研究等領(lǐng)域。
工作原理
實時熒光定量PCR儀的核心原理是利用熒光信號來監(jiān)測PCR擴增過程中的DNA或RNA數(shù)量變化。其基本過程包括以下幾個步驟:
樣本準備:提取待測樣本中的DNA或RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄(若檢測RNA)以生成cDNA。
PCR反應(yīng)體系準備:將模板核酸、特異性引物、DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液和熒光探針或染料混合,加入到PCR反應(yīng)管中。
PCR循環(huán):PCR儀通過循環(huán)變溫步驟(變性、退火和延伸)進行DNA擴增。每個循環(huán)的擴增產(chǎn)物量呈指數(shù)增長。
熒光信號檢測:每次PCR循環(huán)結(jié)束后,儀器通過熒光檢測系統(tǒng)測量熒光強度。熒光強度與擴增產(chǎn)物的數(shù)量成正比。
數(shù)據(jù)分析:根據(jù)熒光信號的變化曲線,軟件自動計算出起始模板的數(shù)量,實現(xiàn)定量分析。
主要組件
熱循環(huán)系統(tǒng):包括加熱和冷卻裝置,用于精確控制反應(yīng)管的溫度,執(zhí)行PCR循環(huán)的變性、退火和延伸步驟。
光學檢測系統(tǒng):包括光源、濾光片和檢測器,用于激發(fā)熒光染料或探針并檢測其發(fā)出的熒光信號。
軟件系統(tǒng):用于控制儀器運行、數(shù)據(jù)采集和分析。軟件可以實時顯示PCR擴增曲線,計算起始模板量,并進行多種數(shù)據(jù)處理和輸出。
熒光檢測技術(shù)
SYBR Green染料:一種非特異性染料,能與雙鏈DNA結(jié)合并發(fā)出熒光。優(yōu)點是簡單易用,成本較低,但可能會產(chǎn)生非特異性信號。
TaqMan探針:一種特異性探針,含有熒光報告基團和猝滅基團。當探針結(jié)合到目標序列上時,Taq酶的5'-3'外切酶活性將報告基團與猝滅基團分離,釋放熒光。優(yōu)點是特異性高,靈敏度強。
Molecular Beacons探針:一種發(fā)夾狀探針,含有熒光基團和猝滅基團。當探針與目標序列結(jié)合時,發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開,釋放熒光。優(yōu)點是特異性強,但設(shè)計和使用相對復(fù)雜。
應(yīng)用領(lǐng)域
基因表達分析:實時定量PCR可以準確測量不同條件下基因的表達水平,廣泛應(yīng)用于基因功能研究和疾病機制研究。
病原體檢測:用于檢測和定量分析病毒、細菌等病原體的存在和數(shù)量,常用于臨床診斷和公共衛(wèi)生監(jiān)測。
遺傳變異分析:可以檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)、插入/缺失變異等遺傳變異,應(yīng)用于個體化醫(yī)學和遺傳病研究。
藥物代謝研究:評估藥物在體內(nèi)的代謝情況,研究藥物對基因表達的影響,應(yīng)用于藥物研發(fā)和毒理學研究。
食品安全檢測:檢測轉(zhuǎn)基因成分、食源性病原體等,確保食品安全。
優(yōu)勢
高靈敏度和特異性:能夠檢測和定量分析極低豐度的核酸,特異性強,適用于復(fù)雜樣本。
實時監(jiān)測:無需后續(xù)處理,實時監(jiān)測擴增過程,減少操作步驟和實驗時間。
定量分析:通過標準曲線或絕對定量方法,準確測量樣本中目標核酸的初始量。
使用注意事項
樣本質(zhì)量:確保樣本中DNA或RNA的完整性和純度,避免抑制劑影響PCR反應(yīng)。
反應(yīng)體系優(yōu)化:優(yōu)化引物和探針設(shè)計,調(diào)整反應(yīng)條件,提高擴增效率和特異性。
數(shù)據(jù)分析:正確設(shè)置熒光閾值和基線,確保數(shù)據(jù)分析準確可靠。
實時熒光定量PCR儀因其高靈敏度、高特異性和定量分析能力,成為現(xiàn)代分子生物學研究和臨床診斷的重要工具。了解其工作原理和使用方法,有助于更好地應(yīng)用該技術(shù),推動科研和應(yīng)用的發(fā)展。