賽默飛熒光定量PCR儀（如QuantStudio系列）**時(shí)應(yīng)注意的關(guān)鍵事項(xiàng)，涵蓋設(shè)備使用、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、數(shù)據(jù)分析、安全等方面：

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段

1. 樣本與試劑準(zhǔn)備

• 樣本應(yīng)避免反復(fù)凍融，保持RNA/DNA質(zhì)量。

• 所有試劑應(yīng)解凍并混勻后再使用。

• 使用低吸附管或PCR專用耗材，減少吸附損失。

2. 反應(yīng)體系設(shè)置

• 嚴(yán)格按照試劑說明書配制體系，注意引物、探針濃度。

• 使用去RNA酶/去DNA酶的無核酸水配制。

• 配置時(shí)操作應(yīng)在冰上進(jìn)行，避免酶活性變化。

3. 加樣操作

• 避免氣泡，影響熒光讀數(shù)。

• 封板前輕輕離心，確保液體在孔底。

• 使用光學(xué)封板膜，確保貼合緊密、無褶皺。

二、儀器操作階段

1. PCR板放置

• 保持板底清潔，避免灰塵、水漬影響檢測(cè)。

• 板放入儀器前注意方向正確，與軟件板圖一致。

2. 通道設(shè)定

• 選擇與試劑染料匹配的熒光通道。

• 若為多重檢測(cè)，確保熒光染料無通道重疊。

3. 擴(kuò)增程序設(shè)置

• 根據(jù)反應(yīng)體系設(shè)定溫度和循環(huán)參數(shù)。

• 通常熒光采集設(shè)在延伸階段。

4. 熔解曲線（如SYBR Green）

• 啟用熔解曲線分析可判斷擴(kuò)增特異性。

• 單一峰形代表反應(yīng)特異性良好。

三、數(shù)據(jù)分析階段

1. Ct值判斷

• Ct值過高（>35）應(yīng)考慮模板濃度、污染或反應(yīng)效率問題。

• 無模板對(duì)照應(yīng)無擴(kuò)增曲線，否則懷疑污染。

2. 擴(kuò)增曲線觀察

• 正常擴(kuò)增曲線呈“S"型。

• 曲線不規(guī)則或漂移可能因加樣誤差或設(shè)備問題。

3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析（絕對(duì)定量）

• R2值應(yīng)接近1，擴(kuò)增效率在90–110%之間較理想。

四、安全與維護(hù)

1. 設(shè)備清潔

• 加熱模塊表面需定期擦拭。

• 避免液體流入樣本槽，若有泄漏立即處理。

2. 避免交叉污染

• 區(qū)分模板制備區(qū)與擴(kuò)增區(qū)。

• 使用過濾吸頭，勤更換手套。

3. 試劑儲(chǔ)存

• 酶類試劑儲(chǔ)存于-20℃，避免頻繁凍融。

• 染料類避光保存，使用后立即蓋緊。

4. 數(shù)據(jù)備份

• 定期導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，避免軟件崩潰造成丟失。

• 軟件升級(jí)前應(yīng)先備份方法與結(jié)果文件。